琼脂糖凝胶电泳实验技巧及异常分析

炖脚盆鸡

跑电泳是分子生物学实验的一项基本技术。只要做分子生物学方面的实验，可能或多或少，或早或晚都要跑跑电泳。
跑电泳的材料是琼脂糖，琼脂糖凝胶电泳实验常用以DNA 切胶回收，DNA 分离和用于佐证DNA 是否重组、质粒等是否切开。今天我们就来聊聊琼脂糖凝胶电泳实验的一些小技巧小细节。

第一步：胶液的制备
称取0.4g 琼脂糖，置于200ml 锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液，放入微波炉里加热，直到琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。
总液体量不宜超过锥瓶的50%容量。否则会溢出来的。毛博就吃过这个亏。还要擦洗微波炉。
加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。

第二步：胶板的制备
倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀。东一块西一块的。果冻做出来就不好看啦。
速度也不可太快，否则容易出现气泡。果冻做出来里面都是气泡。怎么吃呀？
待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶。

第三步：加样
注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。果冻下面被戳个窟窿，还怎么吃呀？

第四步：电泳
加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时，停止电泳。

第五步：染色
未加EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中，室温下染色20-25 分钟。

第六步：观察和拍照
在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB 的电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。

除这些细节之外，还有一些注意事项：
1. 酶切时所加的DNA 溶液体积不能太大，否则DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。
2. 酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1 小时完全降解1 mg λDNA 的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA 不象λDNA 那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
3. 市场销售的酶一般浓度很大，为了省着点儿花，使用时可事先用酶反应缓冲液进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在10%以下，否则，酶活性将受影响。
4. 观察DNA 离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA 分子有切割作用。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm），以减少紫外光切割DNA。
5. EB 是强诱变剂，还有中等毒性，就是有致癌性。配制和使用时都要戴好手套。尽量不要把EB 洒到桌面或地面上。如果真的不幸洒到桌面或地面上了，凡是沾污了EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
6. 当EB 放太多了，胶染色过深，DNA 带看不清的时候，可将胶放入蒸馏水冲泡，30 分钟后再观察。
以上，介绍了做琼脂糖凝胶电泳实验的一些小技巧小窍门，但有时候，跑电泳跑着跑着也会出现一些奇奇怪怪的现象。下面，就谈一谈跑电泳的过程中可能会发生的异常现象，可能的原因，以及处理的方法。

当然，更多的时候，这是一门玄学。
1. 加样孔有荧光
下图的红框部分就是一个典型的加样孔有荧光的例子。发生这种现象可能的原因如下：



首先一定有DNA 的滞留，其次多含蛋白质残留；如果是比较特殊的样品，其杂质也可能导致荧光。蛋白质几乎不会被EB 染色，能出现荧光，则一定含有核酸。非常巨大的基因组DNA (>50kb)，如果使用普通的琼脂糖电泳，往往不能电泳出孔，单独就可能滞留在加样孔中产生荧光。
更多的时候，是比较大的DNA 与残留的蛋白质结合后，电泳不能出孔而在孔中产生荧光。酶反应产物，如果没有经过纯化去除酶，也非常容易在孔中出现荧光，其原因是酶与核酸几乎都有比较强的结合能力(基因组DNA 的PCR 产物电泳往往在孔中都有荧光，而且荧光强度与体系的特异性成反比。)。如果是植物样品，还可能由其它杂质残留引起。
那么，这么多种可能性。到底是什么东西残留呢？
我的经验是：蛋白质残留的荧光有点发闷，其它杂质残留亮得很刺眼，且薄得锐利。如上面那个例子，这么亮，这么锐利，肯定不会是蛋白质啦。

2. 总RNA 非变性电泳显示28S 不如18S 亮
如下图所示，18S 明显地比28S 亮了。



如果28S 和18S 的条带清晰无弥散，那么多提示28S 没有被EB 饱和。RNA 残留多时，基因组DNA 的电泳也会有相似现象。
解决方法：简单的补染就可以解决此问题。再次电泳时，或者降低上样量，或者直接增加胶中EB 的量。保证28S 比18S 亮堂很多很多。


3. 降解
降解的现象，其实是千奇百怪的。可以简单总结如下：主带不再突出，向小片段方向发生弥散，亮度比较均衡地衰减。
如果同时还伴随下列的一个或者多个现象，则需要更进一步的检测：加样孔非常的亮、弥散发生在主条带位置的上下两个方向、从加样孔即开始发生弥散。
如下图所示，红框里面的就是典型的降解的现象。



其实，以现在的裂解液的裂解能力而言，降解的发生主要是在彻底匀浆之前，只有极少量由不干净的溶解液导致。
以总RNA 抽提为例，总RNA 的质量由高到低依次为悬浮细胞、贴壁细胞、组织。彻底裂解悬浮细胞的时间最短，彻底裂解组织的时间最长，这就是降解多发生在彻底匀浆之前的一个佐证。再看一看新鲜样品和冷冻保存样品，非常严格的冷冻保存和匀浆操作的确可以确保冷冻样品的核酸的质量；但是，有许多实验室并不具备严格的保存手段，实验人员的操作也并非完美，其结果就是核酸的降解。
事实上，RNA 抽提受的影响因素太多，就以基因组DNA 的抽提为例看一看吧。
假定消化使用的是含蛋白酶K的溶液，无论你使用的是新鲜样品还是冷冻保存样品，如果混匀彻底，可以预期的降解为：细胞：不应该降解，碾碎的组织：不应该降解，大块组织：部分降解。
如果电泳发现新鲜的细胞和碾碎的新鲜组织发生了降解现象，该现象是假象；如果电泳发现冷冻的细胞和碾碎的冷冻组织发生了降解现象，该现象不是假象，就是样品在保存中已经降解了。
说得更极端一点，即使蛋白酶K 失活了，消化试剂的裂解能力也足以保证细胞的基因组DNA 在抽提过程中间不被降解。
啰哩啰嗦说了这么多。那么，如何才能减少或者杜绝核酸降解呢？
那就是：一定要将重点放在样品被彻底匀浆之前。样品的保存在前面写的RNA 的提取一节里面已经说过了，不重复。其次就是要缩短样品从脱离原来的生存环境或者低温到被彻底匀浆之间的时间。越快越好。

要是实在做不出来，试试换种洗面奶。
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老九门

请问可以转发到知乎动态嘛

宝宝宸

可以

王者百事可乐

谢谢(*°∀°)=3

热心市民李太太

您就是我的哥，您就是我的爷。受用了。老哥，能方便加一下微信么，想请教一下问题。

凡人芯疼

我也想请教问题[微笑]

人鬼情

果冻有毒，不好吃。。

好表哥

现在很少用EB了吧，太毒了，我们实验室都用Goldview.

飞往月球中

写错了吧，我记得酶活力单位是降解1微克的dna

想做村书记

你这跑的是垂直胶还是水平胶啊